二、TOPO克隆PCR产物的纯化回收

1. PCR反应完成后，应对产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，以确认是否存在目标大小的条带。

2. 建议使用切胶回收的方法进行纯化，切胶时间应控制在3分钟内，以避免紫外线对DNA的损伤。使用NanoDrop或OneDrop等仪器检测回收浓度，理想浓度应≥30ng/μl，并再次通过跑胶确认仅存在目标条带。

目的片段连接至载体

1. 按照说明书要求，将连接反应体系中的各组分投入，体积≥1μl。如果浓度过高，建议稀释后使用。

2. 连接反应的温度可以尝试25°C或37°C，时间为5分钟。如果出现低克隆率或克隆空载体/假阳性现象，可将时间延长至30分钟。

感受态细胞转化

1. 对于连接产物的转化，建议使用DH5α或Fast-T1等克隆用化学感受态细胞。

2. 感受态细胞不可重复冻融，建议从-80°C取出后一次性使用。

3. 重组产物与感受态细胞的体积比例为1:10，推荐将10μl重组产物加入到100μl感受态细胞中，或5μl重组产物加入至50μl感受态细胞。

4. 热激时间请按照感受态细胞的说明书进行操作。

5. 平板抗生素抗性应与转化载体的抗性保持一致。

6. 菌液涂板体积：离心菌液（2500×g，3分钟），丢弃多余的LB培养基，保留100μl重悬后全部涂板，或吸取适当体积进行涂板。

单克隆菌落PCR鉴定

1. 从平板中挑选体积适中的单克隆菌落，避免选择过大或过小的菌落。

2. 挑取数个单克隆菌落进行鉴定分析。

3. 将挑取的菌落放入已添加10μl ddH2O的15ml或2ml EP管中，溶解混匀后，吸取1-2μl作为PCR反应（10/20μl体系）的模板。

4. 推荐使用一对分别位于片段和载体上下游的引物进行PCR鉴定。

模板中存在Amp/kana抗性的质粒时，需对目的片段进行切胶回收。

88858cc永利官网是一家专注于生物医药领域的高科技企业，致力于提供优质的产品和技术服务，发展为基因治疗、细胞治疗的领军者。总部设在广州，我们在全国范围内提供最前沿的专业资讯和完善的产品与物流服务。凭借专业的技术力量和广泛的人脉资源，88858cc永利官网可为科研领域的老师和同仁推荐国际先进的高科技产品。作为专业产品供应商，我们拥有大量现货，结合优秀的销售团队和专业技术支持，随时为客户提供服务。